miRNA-424-5p在胰腺癌中的作用及机制研究

【摘要】研究背景:胰腺癌是消化系统比较常见的恶性肿瘤之一,已经成为美国癌症相关死亡原因的第四位。大多数患者在胰腺癌诊断后的12个月后死亡,诊断后能够存活5年者极少。胰腺癌预后差,归因于临床症状出现较晚,早期局部侵犯和高度转移潜能,大多数患者一经诊断即失去手术机会,而胰腺癌患者能够获得较长生存率的唯一的机会便是能够进行根治性手术切除。胰腺癌被认为是一个复杂的与多种基因有关的疾病。迄今为止,多条信号通路与众多的生长因子、癌基因和抑癌基因等的异常表达或激活参与了胰腺癌的发生及发展过程。因此探索胰腺癌的发病机制、寻找新的诊断生物标记物和治疗靶点是提高治疗效果的关键。MicroRNA(miRNA)是近些年来被发现的一类非编码单链小RNA分子,其参与了众多的生物学过程,例如生长、增殖、分化和凋亡等过程。miRNA通过与它们的靶向mRNA的3’UTR区以碱基互补配对的方式结合,导致mRNA降解或抑制其翻译,通过这种机制miRNA降低了靶基因蛋白的表达水平。miRNA的这种负性调节与多种人类肿瘤密切相关,比如胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等。因此深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达及其功能,对探索肿瘤的发病机制具有重要意义,并将有利于对肿瘤的诊断、治疗及预后的判断。ERK1/2信号通路已成为肿瘤发生发展相关因素的研究热点。研究表明ERK1/2可参与多种生物学反应包括细胞增殖与分化、细胞骨架的构建、细胞形态维持、细胞凋亡等。然而ERK1/2在胰腺癌中的作用却知之甚少。目的：检测miR-424-5p在胰腺癌中的表达的情况,探讨miR-424-5p在胰腺癌的发生发展及侵袭转移中的相关功能机制,分析miR-424-5p的靶基因SOCS6与胰腺癌临床病理因素的关系,同时研究miR-424-5p对ERK1/2信号通路的影响。方法：1.收集2009年9月-2012年9月在中南大学湘雅医院手术切除的胰腺癌组织新鲜标本及其癌旁组织各30例,正常胰腺组织标本10例作为对照组。采用实时荧光定量real-timePCR方法检测miR-424-5p在胰腺癌、癌旁及正常胰腺组织中的表达情况。同时用real-timePCR和westernblot方法检测SOCS6的表达情况。分析miR-424-5p与SOCS6的表达之间的关系及SOCS6与胰腺癌患者临床病理关系。2.选取四个胰腺癌细胞系PANC-1、PC-2、SW1990、CFPAC-1用real-timePCR方法检测miR-424-5p的表达差异。选取miR-424-5p高表达的细胞系进行后续试验。将hsa-miR-424-5pinhibitor使用脂质体Lipofectamine2000转染入PANC-1细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组。Real-timePCR检测转染后：miR-424-5p的表达情况。同时用real-timePCR和westernblot方法检测下游靶点SOCS6的表达水平。MTT法检测细胞的增殖并绘制生长曲线；流式细胞术检测细胞的凋亡和细胞周期；Transwell法检测细胞迁移和侵袭的能力。3.运用生物信息学(miRbase,TargetScan,miRanda)的方法,预测SOCS6为其可能的下游靶点并用双荧光素酶报告基因系统验证。4.选取PANC-1细胞系,转染miR-424-5pinhibitor及miR-424-5pinhibitor阴性对照组后,利用westernblot免疫印迹实验观察ERK1/2蛋白在PANC-1细胞中的表达变化；实时荧光定量PCR检测ERK1/2信号通路下游Bcl-2,Mcl-1的变化情况,探讨miR-424-5p对胰腺癌细胞ERKl/2信号通路的影响。结果：1.用real-timePCR检测胰腺癌组织中miR-424-5p相对表达量为0.07407±0.03385,明显高于癌旁组织的0.04601±0.03143和正常胰腺组织中的0.02792±0.01801(P<0.05)。而SOCS6的表达状态却与miR-424-5p相反。SOCS6在胰腺癌中的相对表达量为0.00752±0.00123,低于癌旁组织0.00883±0.00227和正常胰腺组织0.01102±0.00108(P<0.05)。利用spearman双变量相关分析miR-424-5p的表达情况与SOCS6表达的关系,我们得出]miR-424-5p的表达情况与SOCS6表达呈负相关(R=-0.455,P=0.026)。miR-424-5p和SOCS6与患者的性别,年龄,吸烟与否,肿瘤部位,肿瘤大小无明显相关性,而与肿瘤分化程度,TNM分期和淋巴结转移相关。2.利用实时荧光定量PCR检测到miR-424-5p在胰腺癌细胞系PANC-1中表达最高,故选取PANC-1作为下一步实验的细胞系。PANC-1细胞转染miR-424-5pinhibitor后real-timePCR检测证实miR-424-5p被成功抑制。MTT法检测细胞增殖显示miR-424-5p抑制后24-72小时活细胞数量明显低于对照组(P<0.05)。流式细胞技术检测到抑制miR-424-5p后,凋亡细胞的比例增加至18.03%±2.95%,但是对细胞周期无明显影响。抑制miR-424-5p的表达后,PANC-1细胞迁移能力约为阴性对照组的40%,侵袭能力约为阴性对照组的50%,两者都有统计学意义(P<0.05)。3.通过生物信息学方法结合miR-424-5p的生物学特性,SOCS6为miR-424-5p的可能靶蛋白之一,利用双荧光素酶报告基因实验加以验证,分析结果显示,SOCS6是miR-424-5p的直接作用靶基因,并且作用位点位于302-308处。4.PANC-1细胞中转染]miR-424-5pinhibitor后,实验组SOCS6mRNA的相对表达量较对照组增加了30%左右；Bcl-2和Mcl-1mRNA的表达均出现一定程度的下降,约25%左右。Westernblot结果显示miR-424-5pinhibitor组的ERK1/2蛋白表达水平明显下调。提示miR-424-5p是通过ERK1/2信号通路起作用的。结论：1.miR-424-5p在胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中高表达。miR-424-5p的表达与胰腺癌患者的性别,年龄,吸烟与否,肿瘤部位,肿瘤大小无明显相关性,而与肿瘤分化程度,TNM分期和淋巴结转移相关。2.miR-424-5p表达受到抑制后,PANC-1细胞增殖减慢、侵袭迁移能力降低、凋亡细胞数增多,miR-424-5p可能成为胰腺癌基因治疗的一个潜在靶点用生物信息学方法及双荧光素酶方法证实SOCS6为miR-424-5p的直接靶基因。3.miR-424-5p表达抑制后,PANC-1细胞中SOCS6的表达升高,ERK1/2的表达降低,并且ERK1/2信号通路中的Bcl-2,Mcl-1表达降低,提示miR-424-5p可能通过ERK1/2信号通路参与胰腺癌发生发展的过程。
【作者】吴科敏；
【导师】孙维佳；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】胰腺癌；miR-424-5p；SOCS6；ERK1/2信号通路；

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